丝裂素活化蛋白激酶是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者,通过磷酸化活化转录因子而调控特定基因的表达。本实验观察了人高密度脂蛋白对U937细胞信号转导分子ERK1 2表达水平及其磷酸化的影响。人单核—巨噬细胞株U937用含10 %胎牛血清的RPMI 16 4 0培养基,在5 %CO2 、37℃培养箱中培养。待细胞长至5×10 5时,换无血清的RPMI 16 4 0培养基5mL。高密度脂蛋白制备方法,取新鲜抗凝血浆,用超速离心机进行密度梯度离心,收集密度1.0 6 3～1.2 10g cm3组分,PBS透析后冷藏备用。SDS PAGE采用12 %的分离胶,浓缩胶的电流为10mA ,分离胶的电流为15mA ,每孔加约5 0 μg的样本。在转膜前,每一批样本用考马斯亮蓝R2 5 0染色以检测提取细胞蛋白情况。转膜采用10 0mA的电流,时间为2h ,膜为聚偏氟乙烯膜,用前用甲醇浸泡10min左右,封闭液为Pierce公司产品,漂洗液为PBS +5 0 %的吐温,一抗稀释度为1∶2 0 0 ,二抗稀释度为1∶10 0 0 ,温育时间均为室温1h ,显色液为Pierce公司产品。其余步骤按常规操作。Westernblot实验结果显示,高密度脂蛋白刺激ERK1 2表达,并诱导ERK1 2磷酸化水平增加。ERK1 2磷酸化诱导过氧化体增殖物激活型受体γ的磷酸化,而丝裂素活化蛋白激酶特异性抑制剂则阻止过氧化体增殖物激活型受体γ的磷酸化。本实验结果提示,高密度脂蛋白诱导细胞胆固醇流出作用有赖于ERK1 2的参与,同时还可能涉及到过氧化体增殖物激活型受体γ的表达上调,以及LXRα和三磷酸腺苷结合盒转运体A1的参与。