摘要:目的 探讨Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路在缺氧复氧(H/R)诱导的人心肌AC16细胞损伤中的作用及其机制。方法 将体外培养的AC16细胞分为对照组(正常培养)、H/R组(构建H/R模型)、H/R＋NC-siRNA组(转染NC-siRNA后构建H/R模型)和H/R＋RhoA-siRNA组(转染RhoA-siRNA后构建H/R模型),采用MTT法检测AC16细胞存活率,流式细胞术检测AC16细胞凋亡率,比色法检测AC16细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性和Caspase-3活性,ELISA检测AC16细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,试剂盒检测AC16细胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,实时荧光定量PCR检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、核因子κB(NF-κB)p65及IkB激酶(IKK)的mRNA表达水平,Western blot检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65及IKK的蛋白表达水平。结果 与对照组比较,H/R组细胞存活率、SOD水平显著降低,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)；H/R＋NC-siRNA组和H/R组之间上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05)；与H/R＋NC-siRNA组比较,H/R＋RhoA-siRNA组细胞存活率、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。结论 靶向抑制RhoA/ROCK通路可通过降低炎症反应、氧化应激和细胞凋亡减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。

摘要:动脉粥样硬化是一种常见的全身性血管疾病,同时也是多种急性心血管疾病的病理基础。而急性心血管疾病的死亡率高,严重危害人们的生命健康。近年来,越来越多的研究表明RhoA/ROCK信号通路与动脉粥样硬化的形成有密切联系。抑制RhoA/ROCK信号通路可以通过稳定血管内皮功能、抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移、抑制血管钙化、调控炎症细胞聚集以及抑制血小板增殖变形来延缓或抑制动脉粥样硬化的形成。

摘要:目的　研究氟西汀对5-羟色胺（5-HT）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）　RhoA信号通路的影响。方法　培养大鼠PASMC，用氟西汀（0.1、1、10　μmol/L）或法舒地尔（1、10、100　μmol/L）干预后，加入1　μmol/L　5-HT刺激48　h，以噻唑蓝比色法观察细胞增殖情况，以免疫共沉淀、Western　blot等检测RhoA信号通路各指标。结果　5-HT刺激PASMC增殖，使RhoA　5-HT化、RhoA膜转位、Rho激酶蛋白2表达以及肌球蛋白磷酸酶目标亚基1、细胞外调节蛋白激酶、蛋白激酶B磷酸化明显增加；氟西汀剂量依赖地抑制这些改变；而Rho激酶抑制剂法舒地尔对RhoA　5-HT化没有抑制作用。结论　氟西汀通过阻断RhoA信号通路抑制5-HT诱导的PASMC增殖。

摘要:目的 构建血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）基因的RNA干扰慢病毒载体并转染人脐静脉内皮细胞。观察干扰LOX-1表达后对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导内皮细胞损伤的保护机制。方法 针对已经筛选确定的小干扰RNA有效干扰序列，合成慢病毒LV-si-OLR1最佳干扰序列，测定滴度。转染人脐静脉内皮细胞96 h后，通过荧光显微镜观察转染效率，逆转录聚合酶链反应和Western blot检测LOX-1的抑制效率。转染72 h后加入150 mg/L ox-LDL处理24 h；噻唑蓝比色法检测细胞存活率；硝酸还原酶法检测各组内皮细胞培养液一氧化氮（NO）的含量；Western blot检测各组细胞间黏附分子1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、RhoA、Rho激酶1（ROCK1）、Rho激酶2（ROCK2）的表达。结果 测序结果证实，靶向人LOX-1的干扰慢病毒载体构建成功，包装后慢病毒滴度为6×1011 TU/L。转染组与未转染组比较，LOX-1 mRNA与蛋白的表达明显减少（P<0.01）。与正常对照组相比，ox-LDL处理组能明显减低内皮细胞的存活率及NO的生成量，增高ICAM-1、MCP-1、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达（P<0.05）；与ox-LDL处理组相比，干扰LOX-1表达后对ox-LDL诱导的内皮细胞存活率、NO生成量减低和ICAM-1、MCP-1、RhoA、ROCK1、ROCK2表达增高均有明显抑制作用（P<0.05）。结论 干扰LOX-1表达，对ox-LDL诱导内皮细胞引起的ICAM-1、MCP-1高表达和RhoA/Rho激酶信号通路的激活及细胞存活率、NO生成量的减低均有明显抑制作用，起到对内皮细胞损伤的保护作用。本研究为LOX-1作为靶基因治疗动脉粥样硬化提供了实验依据。

摘要:目的研究RhoA/Rho激酶在氟伐他汀（fluvastatin，Flu）影响组织因子蛋白表达过程中的调控作用，探讨氟伐他汀在抗动脉粥样硬化血栓形成作用的新靶点。方法将同一簇人脐静脉内皮细胞（HUVEC）株进行培养、传代后，分设对照组、肿瘤坏死因子α（TNF-α）组、Flu组及干预组（TNF-α+Flu组），采用RT-PCR方法测定组织因子（tissue factor, TF） mRNA表达水平，用Western blot方法测定TF蛋白表达和RhoA的活化水平；随后，以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、Y27632为干预因素，再分设空白对照组、TNF-α+AngⅡ组、AngⅡ组、TNF-α组、TNF-α+Y27632组，采用Western blot方法测定TF蛋白表达水平。结果TNF-α在诱导HUVEC TF表达的同时，可使RhoA活化，氟伐他汀可抑制TF表达与RhoA活化；AngⅡ可促进TNF-α诱导的HUVEC TF蛋白表达水平，而Y27632可抑制TNF-α诱导的HUVEC TF蛋白表达水平。结论RhoA/ Rho激酶通路在G蛋白水平上参与了氟伐他汀抑制组织因子表达的调控机制。

摘要:目的观察在晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白作用下,小G蛋白RhoA及其激活的激酶ROCK在人微血管内皮细胞中分布的变化。方法培养人皮肤微血管内皮细胞株,分别以糖基化修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA)处理不同的浓度和时间,用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察RhoA和磷酸化ROCK在细胞中的分布变化;并用活性型RhoA L63或失活型的RhoA N19转染细胞后再给予AGE-HSA刺激,观察磷酸化ROCK细胞内分布的变化。结果AGE-HSA刺激可以导致RhoA在胞浆中分布增多,其变化随着AGE-HSA作用时间的延长和剂量的增加更加明显。RhoA的下游激酶被活化的磷酸化ROCK在人微血管内皮细胞中的分布与RhoA类似;用失活型RhoAN19先处理细胞后,AGE-HSA介导的ROCK分布变化被抑制。结论晚期糖基化终产物刺激引起小G蛋白RhoA在细胞内分布变化,并导致其下游激酶ROCK磷酸化和定位变化。