摘要:目的 尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法 首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 cDNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果 成功构建pIRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论 成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。

摘要:目的 通过重组表达的方法获得纯化的膜突蛋白(moesin), 利用纯化的重组moesin作为抗原建立间接酶联免疫吸附实验(ELISA)，检测并探讨抗膜突蛋白抗体与动脉粥样硬化相关疾病的关系。方法 设计针对moesin的引物，通过PCR扩增，得到moesin的编码DNA，构建出能够表达moesin的重组质粒，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在适当温度和条件下诱导表达，通过SDS-PAGE电泳鉴定所表达的蛋白，并对重组蛋白进行纯化。利用纯化的重组moesin作建立间接ELISA，采用酶联免疫吸附试验检测120例动脉粥样硬化相关疾病(20例急性冠状动脉综合征、30例原发性高血压、20例颈动脉硬化、20例糖尿病及30例血脂异常症)患者血清抗膜突蛋白抗体，观察抗膜突蛋白抗体的阳性率。结果 表达产物经SDS-PAGE电泳分析，确定所得表达产物为moesin；抗原的最佳包被浓度为4 mg /L，抗体的最佳稀释倍数为1∶100，酶标二抗的最佳稀释倍数是1∶20 000。在120例动脉粥样硬化相关疾病中，抗膜突蛋白抗体的阳性检出率较高，达25%～70%，显著高于正常对照组的5%(P<0.01)；急性冠状动脉综合征组阳性检出率高达70%，高于其它疾病组(P<0.05)，其它各亚型疾病组之间差异无显著性。结论 成功地表达了重组人moesin；建立了最佳的重组moesin作为抗原检测抗膜突蛋白抗体的间接ELISA反应条件；抗膜突蛋白抗体在动脉粥样硬化相关疾病患者中有较高的检出率。

摘要:目的构建针对Rno-miR-145的慢病毒表达载体并探讨其在血小板源生长因子（PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化中的作用。方法 人工合成含有酶切位点粘端miR-145 shDNA双链模板序列，克隆于LV3 pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭载体中,转染293T细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染大鼠原代VSMC,倒置荧光显微镜下观察VSMC感染后的荧光表达情况，实时荧光定量PCR检测miR-145的表达情况；实验分为空白对照组、PDGF组、PDGF+ miR-145组和细胞转染阴性慢病毒载体组（miR-NC组）；采用实时荧光定量PCR测定miR-145对VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun及分化相关基因SM22α mRNA表达水平的影响。结果成功构建了microRNA-145慢病毒载体，测定病毒滴度为1×109TU/mL。倒置荧光显微镜下观察大鼠microRNA-145慢病毒表达载体感染成功，MOI值为50，感染72 h时感染率最高。实时荧光定量PCR结果显示PDGF可使PCNA、c-Jun表达增加，而使SM22α表达降低；miR-145可使PDGF诱导的去分化型VSMC增殖相关基因PCNA、c-Jun表达降低，分化相关基因SM22α表达增加。结论miR-145慢病毒载体可高效感染大鼠原代VSMC。感染miR-145慢病毒后可抑制VSMC的表型转化。

摘要:目的克隆人胱抑素C基因及构建胱抑素C基因真核表达载体并研究其在人血管平滑肌细胞中的表达。方法培养人脐静脉内皮细胞系,并从中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应扩增胱抑素C基因,构建其真核表达载体,双酶切及聚合酶链反应鉴定阳性克隆,转染人血管平滑肌细胞,逆转录聚合酶链反应及Western blot法检测其表达情况。结果成功克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体,转染后成功高表达。结论克隆人胱抑素C基因及构建其真核表达载体成功,转染人血管平滑肌细胞获得其高表达。

摘要:目的设计和构建载脂蛋白M基因特异性的小干扰RNA体内表达载体,筛选抑制载脂蛋白M表达的有效小干扰RNA,并初步探讨载脂蛋白M的功能。方法以载脂蛋白M为目的基因,以产生小干扰RNA质粒载体pSilencerTM2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条小干扰RNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-载脂蛋白。将重组质粒载体plucF-载脂蛋白与产生小干扰RNA的质粒pSilencerTM2.1-U6共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效小干扰RNA,然后将小干扰RNA转染L-02,逆转录聚合酶链反应检测载脂蛋白M mRNA的表达,进一步证实小干扰RNA对载脂蛋白M表达的抑制效果,酶联免疫吸附法检测有效小干扰RNA对载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B和载脂蛋白E合成和分泌的影响。结果合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为86%和91%,并特异性抑制肝细胞载脂蛋白M mRNA的表达;有效小干扰RNA能够有效抑制载脂蛋白AⅠ合成和分泌(p<0.05),而载脂蛋白B和载脂蛋白E的含量无明显改变(p>0.05)。结论成功构建并筛选到针对载脂蛋白M基因表达的有效小干扰RNA质粒,为研究冠心病的发病机制奠定基础。

摘要:目的构建靶向蛋白激酶B基因的短发夹环RNA表达载体,观察其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响。方法设计多个针对大鼠蛋白激酶B基因的短发夹环RNA序列,化学合成方法合成并经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN,包装后获得蛋白激酶B的逆转录表达载体,感染血管平滑肌细胞,Northern blot和Western blot法检测蛋白激酶B及其下游底物的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测血管平滑肌细胞增殖活性的改变。结果成功构建蛋白激酶B基因的逆转录病毒载体并包装,感染血管平滑肌细胞,证实其能显著抑制蛋白激酶B的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染血管平滑肌细胞的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期。结论成功构建蛋白激酶B基因逆转录病毒RNA干扰表达载体,感染血管平滑肌细胞能够明显抑制其分裂、分化和增殖。