摘要:目的 研究维甲酸相关孤核受体α(RORα)调控小胶质细胞M1/M2表型转换在脑梗死发病中的作用机制。方法 ①定向诱导原代小胶质细胞向M1/M2型转化,Western blot检测细胞内RORα及M1标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、M2标记物精氨酸酶1(Arg-1)的表达。②建立大脑中动脉栓塞(MCAO)小鼠模型,Western blot检测各个时间点(6 h、24 h、3天和7天)脑组织中iNOS、Arg-1、RORα的表达。③小鼠侧脑室注射RORα-siRNA,72 h后构建MCAO模型,缺血再灌注后3天,神经行为学评分(Longa评分)对脑功能进行评估,取脑组织,Western blot检测脑组织中iNOS、Arg-1、RORα的表达。④侧脑室注射RORα过表达慢病毒,于7天后构建MCAO模型,缺血再灌注后3天,神经行为学评分(Longa评分)评估小鼠脑功能。结果 脂多糖/γ干扰素(LPS/IFN-γ)可诱导小胶质细胞向M1型转化,白细胞介素4/白细胞介素13(IL-4/IL-13)可诱导小胶质细胞向M2型转化,与对照组比较,RORα在M2型小胶质细胞中表达显著升高,在M1型小胶质细胞表达显著降低(P<0.01)。脑缺血再灌注后,与假手术组比较,iNOS在6 h明显升高并达到高峰,随后表达逐渐下降,Arg-1在3天、7天逐渐升高,RORα在脑缺血再灌注后3天达到最高,7天时明显降低,说明脑缺血损伤后早期以M1型小胶质细胞为主,脑缺血损伤晚期以M2型小胶质细胞为主,RORα在脑缺血损伤中期即M1/M2型小胶质细胞共存期呈现高表达。下调RORα表达后,MCAO小鼠神经行为学评分显著升高,脑功能损伤较为严重。下调RORα后,Arg-1、RORα蛋白表达量显著下降,而iNOS蛋白表达明显增加；上调RORα表达后MCAO小鼠神经行为学评分明显下降,脑功能损伤得到改善；过表达RORα后,Arg-1的表达量显著升高,而iNOS的表达明显较少。结论 RORα可通过调控小胶质细胞由M2型向M1转化参与脑梗死后脑损伤机制。

摘要:目的 研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过诱导miR-33激活核因子κB(NF-κB)途径上调肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的表达,促进炎症反应,加剧动脉粥样硬化(As)。方法 RAW 264.7源性巨噬细胞,经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞后,分别将miR-33 mimics和miR-33 inhibitor转染入细胞内后每组给予5.0 mmol/L的Hcy干预；油红“O”染色确定泡沫细胞模型是否诱导成功；Western blot和实时定量PCR测定NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和mRNA表达；高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量。结果 油红“O”染色后含脂滴的泡沫细胞被染成红色；与其它组相比,miR-33 mimics组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和mRNA表达均增高且细胞内的胆固醇含量增加(P＜0.05)；miR-33 inhibitor组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和mRNA表达均降低且细胞内的胆固醇含量降低(P＜0.05)；空白对照组、miR-33 mimics对照组和miR-33 inhibitor对照组间相比,所有检测指标均无统计学差异(P＞0.05)。结论 Hcy通过诱导miRNA-33激活NF-κB途径上调TNF-α和IL-6的表达,增加炎症反应,促进动脉粥样硬化。

摘要:目的 探讨miR-301a对巨噬细胞炎症因子表达水平的影响,从microRNA角度阐明动脉粥样硬化的发病机制,为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。 方法 高脂喂养ApoE－/－小鼠建立动脉粥样硬化模型,收集小鼠主动脉血管,利用real-time PCR检测组织中miR-301a的表达水平；利用脂质体在RAW264.7细胞中转染miR-301a mimic和miR-301a inhibitor,用real-time PCR检测细胞中miR-301a水平,并检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达水平,用Western blot检测NF-κB抑制因子(NKRF)蛋白水平,用免疫荧光染色检测p65细胞定位。 结果 在高脂喂养的ApoE－/－小鼠主动脉血管壁组织中miR-301a的表达水平升高；在RAW264.7细胞中过表达miR-301a可抑制NKRF蛋白水平,促进p65细胞核定位,升高细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1 的mRNA表达；在RAW264.7细胞中低表达miR-301a可升高NKRF蛋白水平,促进p65细胞质定位,减少细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达。 结论 在高脂喂养的ApoE－/－小鼠主动脉血管壁组织中miR-301a表达水平升高；在RAW264.7细胞中miR-301a通过调节NKRF的表达影响p65活性进而调控TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA表达,提示microRNA在动脉粥样硬化发病的炎症机制中具有重要作用。

摘要:目的 观察碱性环境中高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞中电导钙激活钾通道(KCa3.1)与大电导钙激活钾通道(KCa1.1)表达的变化,以及探究钙激活钾通道与大鼠胸主动脉平滑肌细胞表型转化之间的关系。方法 采用组织块贴壁法培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞,利用10 mmol/L β-甘油磷酸钠制备血管平滑肌细胞钙化模型。使用HCl和NaHCO3调节培养基pH值。细胞随机分为5组:正常pH 7.4组、高磷pH 7.4组、高磷pH 7.7组、高磷pH 8.0组、TRAM-34干预组,共培养4天。用逆转录-聚合酶链反应检测各组细胞中KCa3.1、KCa1.1α、KCa1.1β、Runt相关转录因子2(Runx2)和平滑肌22α(SM22α)表达。结果 与正常pH 7.4组相比,高磷组Runx2水平明显升高,且随着pH升高而表达量增加(P<0.05)；高磷组SM22α水平明显下降,且随着pH升高而表达量减少(P<0.05)。与正常pH 7.4组相比,高磷pH 7.4组KCa3.1表达升高(P<0.05),KCa1.1α表达下降(P<0.05)。在高磷组中,随着pH升高KCa3.1、KCa1.1α表达量增加(P<0.05)。在同一组中KCa3.1表达高于KCa1.1α(P<0.05)。KCa1.1β表达在3个高磷组间未见统计学差异(P>0.05)。与高磷pH 8.0组相比,TRAM-34干预组Runx2 mRNA水平明显下降(P<0.05),SM22α mRNA水平明显上升(P<0.05)。相关分析显示,KCa3.1表达与Runx2表达呈正相关(r＝0.945,P<0.01),与SM22α表达呈负相关(r＝－0.926,P<0.01)；在正常pH 7.4组、高磷pH 7.4组中KCa1.1α表达与Runx2表达呈负相关(r＝－0.746,P＝0.029),与SM22α表达呈正相关(r＝0.971,P＝0.002)；在高磷pH 7.7组、高磷pH 8.0组中KCa1.1α表达与Runx2表达呈正相关(r＝0.805,P＝0.002),与SM22α表达呈负相关(r＝－0.806,P＝0.005)；KCa1.1β表达与Runx2、SM22α表达不相关(r＝0.414,P＝0.356；r＝－0.155,P＝0.714)。结论 碱性环境中平滑肌细胞钙激活钾通道表达参与高磷诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞的表型转化。

摘要:胆固醇逆转运(RCT)是体内清除胆固醇的重要机制,对维持体内胆固醇稳态,预防动脉粥样硬化有着重要意义。ATP结合盒转运体A1(ABCA1)是胆固醇逆转运过程中的关键因子,ABCA1的表达受到转录水平和转录后水平的多种因素调控,其中microRNA介导ABCA1表达的转录后水平调控备受重视。近年来的研究发现,多种microRNA能直接以ABCA1为靶基因调控ABCA1的表达,同时也发现一些microRNA通过作用于调控ABCA1基因的转录因子间接发挥效应,如肝X受体α(LXRα)、过氧化体增殖物激活型受体γ(PPARγ)、视黄醇类核内受体α(RXRα)等间接调控ABCA1的表达,从而达到影响胆固醇流出的目的。这些microRNA包括miR-33a/b、miR-19b、miR-27a/b、miR-302、miR-758及miR-106b等。本文主要综述已知microRNA对 ABCA1表达的影响。

摘要:目的　探讨肝X受体α（LXRα）激动剂对巨噬细胞中Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化导致成熟白细胞介素1β（IL-1β）水平升高的影响及其机制，为探索同时具有抗炎和调脂能力的防治动脉粥样硬化药物新靶点提供实验支持。方法　THP-1细胞经佛波酯活化成为人源性巨噬细胞，在培养基中加入胆固醇晶体（1　μg/L）为模型组，其它各组在模型组基础上分别加入高剂量（30　μmol/L）、中剂量（10　μmol/L）、低剂量（3.3　μmol/L）的LXRα激动剂GW3965以及GW3965　10　μmol/L＋GGPP　10　μmol/L、GGPP　10　μmol/L、GW3965　10　μmol/L＋ABCA1抗体（1∶200）、GW3965　10　μmol/L＋载脂蛋白E抗体（1∶200），48　h后提取总RNA、总蛋白、核蛋白和培养基蛋白。利用real-time　PCR和Western　blot对相应指标的mRNA和蛋白水平进行检测。结果　模型组成熟IL-1β蛋白水平、NLRP3和Caspase-1的mRNA和蛋白水平与对照组有显著差异（P<0.05）；与模型组相比，GW3965中、高剂量组上述指标均有显著减低（P<0.05），LXRα抑制剂GGPP能显著抑制GW3965的作用（P<0.05），载脂蛋白E抗体及ABCA1抗体均对GW3965中剂量的活性无显著影响，单独使用GGPP处理的细胞各项指标与模型组无显著差异。结论　LXRα激动剂能够显著抑制巨噬细胞模型中由胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体导致的IL-1β水平升高，且此作用与抑制核因子κB（NF-κB）信号通路有关。

摘要:目的　探讨酰基化Ghrelin是否可保护3T3-L1小鼠脂肪细胞免受肿瘤坏死因子α（TNF-α）所介导的炎症损伤。方法　成熟3T3-L1脂肪细胞分为对照组、TNF-α处理组、酰基化Ghrelin处理组、酰基化Ghrelin　+　TNF-α处理组。干预完成后，分别检测3T3-L1脂肪细胞上Toll样受体4（TLR-4）　mRNA及蛋白水平、核因子κB　p65（NF-κB　p65）磷酸化蛋白水平以及细胞上清液中脂联素和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达水平。结果　①与对照组比较，TNF-α处理组3T3-L1脂肪细胞TLR-4　mRNA和蛋白水平、NF-κB　p65磷酸化蛋白水平均上调，细胞分泌MCP-1增多，脂联素减少（P<0.05，n5）。②与对照组比较，酰基化Ghrelin处理组TLR-4　mRNA和蛋白水平以及NF-κB　p65磷酸化蛋白水平下降（P<0.05，n5），脂肪细胞分泌脂联素减少（P<0.05，n5），MCP-1仅有下降趋势（P>0.05，n5）。③与TNF-α（100　μg/L）处理组比较，酰基化Ghrelin预孵育4　h可下调TNF-α所致的3T3-L1脂肪细胞TLR-4　mRNA表达增多，其蛋白水平以及NF-κB　p65磷酸化蛋白水平亦有所下调（P<0.05，n5），且呈剂量依赖性；而脂肪细胞MCP-1及脂联素的分泌水平差异无显著性（P>0.05，n5）。结论　TNF-α导致3T3-L1细胞TLR-4、NF-κB　p65炎症通路活化，脂肪细胞分泌促炎因子（MCP-1）增加，而抗炎因子（脂联素）减少；酰基化Ghrelin可剂量依赖性抑制TNF-α介导的3T3-L1细胞TLR-4、NF-κB　p65炎症通路的活化，但不能完全改善脂肪细胞分泌促炎因子和抗炎因子的紊乱。

摘要:目的 以大鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，经ox-LDL（50 mg/L）诱导后建立巨噬细胞泡沫化模型，观察泽泻汤对细胞LXRα 和ABCA1表达的影响。 方法 分别采用ox-LDL（50 mg/L）和Dil-ox-LDL（10 mg/L）处理大鼠腹腔巨噬细胞24 h，同时20%泽泻汤血清干预后，油红O染色和荧光显微镜观察细胞内脂质沉积情况；蛋白免疫印迹检测细胞LXRα 和ABCA1的表达情况。结果 ox-LDL（50 mg/L）和Dil-ox-LDL（10 mg/L）处理巨噬细胞成功建立巨噬细胞泡沫化模型；与空白组的巨噬细胞比较，模型组巨噬细胞内脂质沉积增加，泽泻汤血清干预组巨噬细胞内脂质沉积明显减少。空白组巨噬细胞和模型组巨噬细胞LXRα呈低水平表达，泽泻汤血清干预组细胞LXRα表达明显增加；与空白组比较，模型组巨噬细胞ABCA1表达明显增加，泽泻汤血清干预组巨噬细胞中ABCA1亦呈高表达，但较模型组略低。结论 ox-LDL（50 mg/L）和Dil-ox-LDL（10 mg/L）处理巨噬细胞可以成功建立巨噬细胞泡沫化模型；泽泻汤能改善巨噬细胞泡沫化过程的脂质沉积，可能通过上调LXRα表达来实现的。

摘要:目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默Toll样受体4（TLR4）基因对慢性温和应激ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞促炎症细胞因子表达的影响。方法针对小鼠TLR4基因设计2条siRNA和一条无关序列，再据每一序列合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA，退火后与含GFP的载体pRNAT-H1.1/Adeno相连，转染293A细胞，实时荧光PCR筛选有效的一条siRNA，经腺病毒颗粒包装与病毒扩增并感染293A细胞，G418筛选后，挑取单个阳性克隆放大培养，检测病毒滴度。120只雄性ApoE-/-小鼠随机分为三组：（1）慢性温和应激组；（2）慢性温和应激＋siRNA组(10 μL/只，尾静脉注射，每5日一次)；（3）慢性温和应激＋腺病毒空载体组。每组ApoE-/-小鼠40只，实验动物都以高脂、高胆固醇饲料喂养，分别在接受慢性温和应激0、4、12周后3个时间点处死动物，收集小鼠腹腔单核巨噬细胞，以Western Blotting方法检测其TLR4和核因子κB（NF-κB）蛋白表达，ELISA法检测腹腔单核巨噬细胞培养上清液白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α表达。结果转染siRNA1和siRNA2后的292A细胞中TLR4 mRNA表达水平较空白对照组分别下降56％和67%, 逐孔稀释滴度测定法测定的病毒滴度为3.4×1014TU/L；遭受4、12周慢性温和应激后，ApoE-/-小鼠血浆中皮质醇激素显著升高，但在同一时间点内，各组ApoE-/-小鼠血浆皮质酮激素浓度相比，差异没有统计学意义(p>0.05)；与同一时期慢性温和应激组相比，siRNA组腹腔巨噬细胞TLR4和核因子κB蛋白表达水平明显降低 (均p<0.05)，其培养细胞上清液中的白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α含量显著减少(p<0.01)。结论siRNA沉默TLR4基因能有效抑制TLR4 /NF-κB-IL-1β 和肿瘤坏死因子α的表达，提示TLR4/ NF-κB途径在慢性温和应激诱导的慢性炎症应答中可能有着重要作用。

摘要:目的探讨非诺贝特对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导3T3-L1成熟脂肪细胞中炎症相关蛋白CD40L/CD40表达的影响及其是否通过Sirt1-NF-κB途径调控TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症反应。方法3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化成为成熟脂肪细胞后,免疫荧光检测Sirt1及CD40L/CD40的表达定位。TNF-α刺激细胞以及加入非诺贝特、Sirt1特异性激动剂和抑制剂和NF-κB信号通路阻断剂后,采用免疫印迹法检测细胞内Sirt1、CD40和NF-κB蛋白表达水平,采用RT-Q-PCR检测Sirt1和CD40 mRNA表达水平。结果油红O染色结果表明成功建立诱导分化体系。Sirt1在3T3-L1成熟脂肪中有表达且主要定位于细胞核。免疫荧光和逆转录PCR结果表明,3T3-L1成熟脂肪细胞表达CD40且主要定位于细胞膜上,但不表达CD40L。非诺贝特剂量依赖性下调TNF-α(10μg/L)诱导的成熟脂肪细胞中CD40蛋白和mRNA的表达,上调TNF-α诱导的成熟脂肪细胞中Sirt1蛋白和mRNA的表达。Sirt1特异性激动剂白藜芦醇增强非诺贝特对TNF-α诱导的成熟脂肪细胞中CD40蛋白和mRNA表达的抑制作用,组蛋白去乙酰化酶抑制剂尼克酰胺和Sirt1特异性抑制剂Sirtinol减弱非诺贝特的抑制作用。且当NF-κB信号通路阻断后,CD40蛋白和mRNA表达水平显著降低。结论非诺贝特抑制TNF-α诱导3T3-L1成熟脂肪细胞中CD40的表达,且其可能通过Sirt1-NF-κB途径调控TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症反应。